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ibidi腔室載玻片|揭示鈣成像細胞信號轉(zhuǎn)導的奧妙!

更新時間:2023-06-29   更新時間:2023-06-29   點擊次數(shù):1208次

  細胞內(nèi)的鈣稱為細胞內(nèi)鈣,可受到高度調(diào)節(jié);這種緊密的調(diào)節(jié)使細胞內(nèi)鈣成為了解細胞功能和信號動力學的較佳的工具,使其能夠在細胞遷移、交流和對刺激物或異物作出反應的能力。

  

  鈣:細胞過程的多功能指示劑

   

  鈣信號可作為讀數(shù)來了解病毒在感染過程中利用宿主信號反應的能力,并剖析所涉及的信號通路。有幾種細胞內(nèi)鈣的熒光指示劑是可用于研究細胞功能;能夠檢查傷口愈合、傳染病、藥物治療等過程中的細胞反應。為此可利用含有熒光鈣指示劑的細胞的活細胞成像,其中熒光的增加表明細胞內(nèi)鈣的增加。

  

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  鈣指示劑的種類及其應用

  

  鈣指示劑主要分為兩大類:化學指示劑和基因編碼的鈣指示劑。可用于活細胞成像實驗的鈣指示劑類型取決于預期的細胞系、成像長度以及定性或定量數(shù)據(jù)的預期結果等因素。

  

  1.預期細胞系:

  

  對于原代細胞系直接的方法是使用熒光染料,將熒光鈣指示劑簡單地添加到培養(yǎng)的細胞中,并在孵育期后成像。


  與基因編碼的鈣指示劑相比,熒光染料通常更亮、更穩(wěn)定。在活細胞成像中,熒光染料可以有效地進行短期活細胞成像,但隨著時間的推移細胞有排出染料的趨勢。鈣染料的一個重要考慮因素是使用抑制劑還是激動劑。抑制劑和激動劑也可能影響鈣染料反映,類似于在天然組織中的表達。

  

  在廣泛的鈣信號傳導實驗中,已建立的細胞系是可以被轉(zhuǎn)導以表達遺傳編碼的鈣指示劑,如GCaMP、黃色cameleon等。對現(xiàn)有的不同基因編碼鈣指示劑進行改進,使指示劑更亮,光穩(wěn)定性更好,動態(tài)范圍更大,從而提高了鈣的敏感性。慢病毒轉(zhuǎn)導是細胞系中使用的一種較佳的工具,它將允許您選擇的指示劑在細胞系中穩(wěn)定表達?;蚓幋a報告系統(tǒng)的一個潛在問題是,并非所有細胞系都容易被轉(zhuǎn)導?! ?/span>

  

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  在用ADP 進行激動劑治療期間,人腸道類器官單層的實時、短期成像。這些有機體單層以綠色表達鈣指示劑 GCaMP6s。ADP 是一種已知的激動劑,用于在細胞中引發(fā)細胞內(nèi)鈣信號傳導。激動劑治療是測試治療劑量反應的較的好方法。

  

  2.成像長度

  

  對于活細胞成像,時間長度和間隔是需要記住的重要參數(shù)。細胞成像過程中的主要關注的是光漂白和光毒性。應避免持續(xù)使用激發(fā)光,重要的是選擇足夠強的曝光時間和光功率,以檢測鈣信號,但不要過強,以免對細胞造成損害。成像的長度將取決于實驗。對于測試激動劑或細胞反應,這通常是5-20分鐘的較短成像運行,每1-2秒捕獲一次圖像。對于研究傷口修復或病毒感染期間鈣信號傳導的實驗,我們會在18-20小時內(nèi)成像,每分鐘捕捉一次圖像?! ?/span>

  

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  活細胞成像的技巧

  

  考慮要使用的細胞系是很重要的。為了研究鈣動力學,使用形成單層的細胞系將確保感興趣的區(qū)域保持聚焦,以捕捉信號動力學,從而獲得較佳質(zhì)量的視頻和清晰的量化。對于涉及細胞間通訊和鈣動力學的實驗,細胞系融合也是一個重要的考慮因素。為了獲得質(zhì)量的圖像,選擇合適的載玻片非常重要。有些細胞培養(yǎng)物更喜歡玻璃載玻片而不是光學級塑料載玻片,因此最好測試腔室載玻片。我們的細胞系使用ibiTreat μ-Slide 8 Well high八孔高壁腔室載玻片?! ?/span>

  

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μ-Slide 8 Well high(貨號: 80806)

  

  活細胞成像是使細胞的密度允許形成一個融合的單層,但不會導致細胞過度擁擠和團塊。在成像過程中需要使用合適的培養(yǎng)基。許多傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)基含有酚紅,它可引起高背景熒光。這使得在成像過程中很難從背景噪聲中分離出真實信號。因此,重要的是用PBS洗滌細胞,并用無酚紅培養(yǎng)基或市售的用于活細胞成像的培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基?! ?/span>

  

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