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細(xì)胞劃痕實驗太難?看它如何四步搞定樣品制備到圖像分析

更新時間:2024-02-20   更新時間:2024-02-20   點擊次數(shù):1093次

  傷口愈合測定是一種研究體外細(xì)胞遷移的簡單方法。ibidi Culture-Insert 傷口愈合插件系列產(chǎn)品為傷口愈合實驗提供了完整的解決方案,從樣品制備到圖像分析只需四個步驟。

  

  本應(yīng)用是使用ibidi Culture-Insert 2 Well傷口愈合插件分析MCF-7細(xì)胞遷移的詳細(xì)方案。

  

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圖 1. 使用ibidi Culture-Insert 2 Well行傷口愈合測定的實驗工作流程


  實驗操作流程:

  

  步驟1:細(xì)胞接種

  

  為建立可靠的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng),須在實驗開始前確定實驗參數(shù)。例如:選擇正確的細(xì)胞接種密度。我們建議使用24小時后產(chǎn)生百分之100光學(xué)融合細(xì)胞層的密度。

  

  1.像往常一樣準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。建議包括離心步驟,以去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。將細(xì)胞懸浮液調(diào)節(jié)至約3x105個細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度,以在24小時后獲得融合的細(xì)胞層。

  

  2. 將70µl細(xì)胞懸液滴入培養(yǎng)皿2孔插件的每個孔中。避免搖晃µ-Dish培養(yǎng)皿,因為這將導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。

  

  3. 將細(xì)胞在37°C和百分之5 CO2下培養(yǎng)至少24小時。

  

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圖2. 在高壁預(yù)置傷口愈合2孔插件培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞

  

  步驟2:劃痕形成

  

  融合細(xì)胞層是開始該測定的先決條件。移除高壁傷口愈合2孔插件培養(yǎng)皿后加入新鮮培養(yǎng)基。如有必要,在培養(yǎng)基中補充抑制或增強物質(zhì),以評估其對細(xì)胞遷移行為的影響。

  

  1. 24小時后在顯微鏡下檢查細(xì)胞密度。如果24小時后仍未形成細(xì)胞融合層,則將µ-Dish培養(yǎng)皿再次放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)12-24小時。定期檢查匯合處。

  

  2. 用無菌鑷子輕輕取出傷口愈合2孔插件培養(yǎng)皿。如圖3所示,用鑷子輕輕夾住插件的一角取出插件。

                      

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圖3.使用無菌鑷子移除傷口愈合2孔插件培養(yǎng)皿

  

  3.移除插件后,檢查細(xì)胞層是否仍附著在μ-Dish培養(yǎng)皿的表面。

  

  4.用無細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS清洗細(xì)胞層,去除細(xì)胞碎片和未附著的細(xì)胞。

  

  5.推薦使用體積為2mL的無細(xì)胞培養(yǎng)基填充μ-Dish培養(yǎng)皿。

  

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圖4. 由高壁預(yù)置傷口愈合2孔插件培養(yǎng)皿創(chuàng)建的無細(xì)胞間隙

  

  步驟3:獲取顯微鏡圖片:

  

  我們建議錄制延時視頻,以確定時間依賴性和細(xì)胞遷移的特征。

  

  1. 將培養(yǎng)皿放在顯微鏡上并移動,直到圖像中捕捉到間隙和兩個細(xì)胞的正面。使用4x/5x或10x物鏡。傷口區(qū)域的方向并不重要,但需要水平或垂直。

  

  2. 在接下來的幾個小時內(nèi),通過多次拍攝圖像開始觀察過程。

  

  3. 以30分鐘的時間間隔對在ibiTreat表面上培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行20小時的時間推移測量。

  

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圖5.使用MCF-7細(xì)胞的遷移測定的時間流逝測量

  

  步驟4:使用FastTrack AI和數(shù)據(jù)解釋進(jìn)行定量圖像分析

  

  必須分析顯微照片以獲得關(guān)于培養(yǎng)細(xì)胞的遷移特征的信息。這可以通過使用圖像處理軟件手動完成,也可以通過使用ibidi提供的傷口愈合快速通道人工智能圖像分析進(jìn)行自動圖像分析。

  

  這里顯示的示例數(shù)據(jù)是使用FastTrack AI進(jìn)行分析的。自動圖像分析檢測細(xì)胞覆蓋面積。繪制細(xì)胞覆蓋面積隨時間的變化圖,顯示間隙閉合的過程。線性相位可以用來表征遷移(=傷口閉合的速度)。

  

  線性相的斜率顯示,劃痕閉合的平均速度為0.0184*106µm2/小時(=0.44*106µm2/天)。

  

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圖6. FastTrack AI對傷口愈合實驗的定量圖像分析


  高壁預(yù)置傷口愈合2孔插件培養(yǎng)皿放置在細(xì)胞培養(yǎng)表面上,提供兩個細(xì)胞培養(yǎng)庫,每個庫由一條500μm壁隔開。在兩個儲液庫中填充細(xì)胞懸浮液僅允許細(xì)胞在設(shè)置區(qū)域生長。移除培養(yǎng)插件在適當(dāng)?shù)募?xì)胞附著后,產(chǎn)生大約500 μm的無細(xì)胞間隙。

  

  在顯微鏡評估傷口愈合過程。根據(jù)您感興趣的焦點,可以通過使用視頻顯微鏡或通過在不同時間點觀察圖像來完成。測量細(xì)胞覆蓋區(qū)域的變化允許量化傷口閉合的速度并提供細(xì)胞遷移特征。  


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